Kurzfristiges Fasten induziert eine tiefgreifende neuronale Autophagie Einführung

Autophagie ist ein wichtiger homöostatischer Mechanismus, dessen physiologische Bedeutung durch seine Konservierung im eukaryontischen Stammbaum von der Hefe bis zum Säugetier widergespiegelt wird. In den letzten Jahren wurde die Autophagie als wichtiger Abwehrmechanismus gegen Malignome, Infektionen und neurodegenerative Erkrankungen erkannt. Die Aufhebung der Autophagie in Neuronen kann zu neurodegenerativen Erkrankungen führen und Autophagie kann eine Rolle bei der Entwicklung der Alzheimer-Krankheit spielen; tatsächlich wurde eine Verbesserung der Autophagie als eine mögliche Behandlung für diese kommende Geißel vorgeschlagen. Daher wird viel geforscht, um zu versuchen, Medikamente zu entwickeln, die die neuronale Autophagie im intakten ZNS hochregulieren können. Hierin liefern wir Beweise, die die Idee unterstützen, dass das gewünschte physiologische Ziel durch einen einfachen, sicheren und kostengünstigen alternativen Ansatz erreicht werden kann: kurzfristige Nahrungsbeschränkung.
Studien an Hefe und in Gewebekulturen haben wesentlich zu unserem Verständnis der molekularen Vorgänge bei der Autophagie und ihrer Regulation beigetragen. In intakten Organen und Geweben und insbesondere im Gehirn war der Vorgang jedoch schwer zu beobachten. Dies ist nicht auf das Fehlen von in-vivo-Säugermodellen zurückzuführen. Um beispielsweise die Identifizierung und Analyse von autophagie auslöser in vivo zu erleichtern, wurde eine transgene Maus generiert, die für eine Fusion zwischen GFP und der leichten Kette des Mikrotubuli-assoziierten Proteins 1 kodiert. Die lipidierte Form von LC3 assoziiert spezifisch mit Autophagosomen und dieses Protein ist derzeit der am häufigsten verwendete Marker für Autophagie in Säugerzellen. Andere haben diese GFP-LC3-Mäuse verwendet, um die Auswirkungen der Nahrungsbeschränkung in vivo zu bestimmen. Es ist bekannt, dass Nahrungsrestriktion in vielen Organen und Geweben Autophagie induziert, aber Autophagie wurde im Gehirn selbst nach 48 Stunden Nahrungsrestriktion noch nicht nachgewiesen; Daher wurde vorgeschlagen, dass das Gehirn metabolisch privilegiert ist und dass eine schwerere Verletzung, beispielsweise eine direkte Verletzung, die durch eine lokale Ischämie oder ein Trauma vermittelt wird, erforderlich sein kann, um eine autophagische Reaktion in diesem Organ auszulösen. Hier kombinieren wir zwei gut charakterisierte Techniken, um die Wirkung einer kurzen Nahrungsbeschränkung auf die neuronale Autophagie zu untersuchen. Wir zeigen, dass dieser Ansatz Autophagosomen mit einer Auflösung identifiziert, die es erlaubt, sie nicht nur aufzuzählen, sondern auch detailliert zu charakterisieren. Darüber hinaus haben wir einen Standardansatz – Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) – verwendet, um die erhöhte Häufigkeit von Autophagosomen in Neuronen von Mäusen mit eingeschränkter Nahrungsaufnahme zu bestätigen. Unsere Daten zeigen, dass die Nahrungsrestriktion entgegen dem gängigen Dogma eine schnelle und tiefgreifende Hochregulation der Autophagie im Gehirn bewirkt.
Ergebnisse
Sechs bis sieben Wochen alte männliche GFP-LC3-Mäuse wurden für 24 oder 48 Stunden von Nahrung ausgeschlossen, ein Prozess, von dem bekannt ist, dass er Fettveränderungen und Autophagie in der Leber induziert. Wasser stand ad libitum zur Verfügung. Diese nahrungsbeschränkten Mäuse und Kontrollmäuse wurden eingeschläfert (durch PBS-Perfusion) und Leber- und Gehirnvibratomschnitte wurden hergestellt und gefärbt, wie in den experimentellen Verfahren beschrieben. Konfokale Bilder wurden aufgenommen und analysiert.
Die konfokale Mikroskopie von Vibratomschnitten identifiziert Autophagosomen in der Leber von Mäusen mit eingeschränkter Nahrungsaufnahme.
Wir haben die Methode zunächst validiert, indem wir die Leber analysiert haben, ein Organ, von dem bekannt ist, dass es durch Nahrungsbeschränkung Autophagie verursacht. Repräsentative konfokale Bilder der Leber sind in gezeigt Wie erwartet war in der Leber einer C57BL/6-Maus im Wesentlichen kein GFP-Signal vorhanden. Bei normal gefütterten GFP-LC3-Mäusen war das GFP-Signal in Hepatozyten nachweisbar und im Zytosol verteilt. Nach 24 Stunden Nahrungsbeschränkung konnten einzelne Autophagosomen als ausgeprägte Regionen mit hoher Fluoreszenz nachgewiesen werden, und Autophagosomen waren nach 48 Stunden noch häufiger. Die hohe Auflösung des Ansatzes ermöglichte quantitative Analysen einzelner Autophagosomen. Wir konnten nicht nur die Anzahl der Vesikel pro Zelle messen, sondern auch deren Oberfläche, Umfang, Frettchen (der längste Durchmesser innerhalb einer eingeschlossenen unregelmäßigen Form) und Rundheit. Die erste Reaktion auf die Nahrungsbeschränkung, die nach 24 Stunden beobachtet wurde, war eine signifikante Zunahme der Zahl. Die Autophagosomen-Eigenschaften änderten sich ebenfalls mit Zunahme des Umfangs und der Bünde, einer verringerten Kreisförmigkeit und einer leichten Zunahme der Oberfläche. Alle diese Veränderungen wurden nach 48 Stunden Nahrungsbeschränkung vergrößert. Wichtig ist, dass die physikalischen Eigenschaften dieser Autophagosomen denen ähnlich sind, die zuvor mit konventioneller Elektronenmikroskopie beschrieben wurden

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